T7 RNA聚合酶
1. 产品描述
作为生物大分子，mRNA 只能通过体外转录（IVT，in vitro transcription）的方法大规模合成，T7 启动子是目前转录效率***的启动子之一，因此采用 T7 RNA 聚合酶（T7 RNA Polymerase）进行体外转录可获得更多的合成产物。本制品 T7 RNA Polymerase（T7 RNA 聚合酶）为噬菌体 T7 DNA 编码的酶，是一种高度特异识别 T7 启动子序列的 DNA 依赖的 5'→3' RNA 聚合酶，以含有 T7 启动子序列的单链或双链 DNA 为模板，以 NTP 为底物，合成与 DNA 中一条链互补的 RNA。T7 RNA 聚合酶是体外转录生产治疗用 mRNA 的关键酶。本品为利用大肠杆菌大规模发酵表达的 GMP 级重组 T7 RNA 聚合酶，采用药用规格原辅料生产，并严格控制宿主蛋白质残留、核酸残留等，符合GMP 规范的产品生产与质量管理规程保障生产过程及所有原辅料可追溯。
2. 质量要求
项目 | 标准 |
外观 | 应为澄明液体 |
可见异物 | 不超过3个/支 |
装量 | 不低于4mL/支 |
鉴别（SDS-Page） | 应与参比品条带一致 |
蛋白浓度（RP外标法） | 应为标识浓度的±10% |
pH值 | 7.9±0.5 |
细菌内毒素 | ＜10EU/mL |
非特异性核酸酶残留 | 琼脂糖电泳凝胶显示应为阴性 |
核酸内切酶残留 | 琼脂糖电泳凝胶显示应为阴性 |
核酸外切酶残留 | 琼脂糖电泳凝胶显示应为阴性 |
RNA酶残留 | 琼脂糖电泳凝胶显示应为阴性 |
HCP残留 | ≤50ng/ mg |
HCD残留 | ≤100pg/ mg |
镍盐残留 | ≤10ppm |
重金属残留 | ≤10ppm |
纯度（SEC-HPLC） | ≥95.0% |
纯度（RP-HPLC） | ≥95.0% |
活性 | 应不低于50KU/mL; |
微生物限度 | 应不高于1CFU/1mL |
3. 遵循生产规范
1-《GMP 附录-细胞治疗产品》***药品监督管理局。
2-《人用基因治疗总论-中国药典2020》***药典委。
3- USP Chapter , Ancillary Materials for Cell, Gene, and Tissue-Engineered Products 用于细胞治疗，基因治疗和组织工程产品中的辅料。
4- USP Chapter , Growth Factors and Cytokines Used in Cell Therapy Manufacturing 细胞治疗产品生产过程中细胞因子和生长因子。
5- Ph. Eur. General Chapter 5.2.12, Raw Materials of Biological Origin for the Production of Cell-based and Gene Therapy Medicinal Products 用于生产细胞或基因治疗药物的生物来源原料。
4. 产品基本信息
来源 | 携带噬菌体 T7 DNA 基因的 E. coli |
储存缓冲液 | 50 mM Tris-HCl (pH 7.9)；100 mM NaCl；10mM DTT；1 mM EDTA；0.1% Triton X-100；50% (v/v) Glycerol |
储存条件 | -20±5℃ |
5. 产品特点
5.1更好的酶活
通过定点突变技术，对 T7 启动子有高度特异性。相同完整率下，远高于市售主流竞品的产率。
RNA生成量（μg） | ||
时间（min） | KK市售产品 | 乐布斯产品 |
180 | 64.8 | 97.8 |
150 | 65.3 | 95.1 |
120 | 59 | 93.6 |
90 | 57.1 | 91.1 |
60 | 55.5 | 86.7 |
30 | 43.6 | 67.4 |
10 | 24.9 | 61.6 |
与KK竞品对比测试，在3h反应时间下产量提升50.9%
样品名称 | 浓度μg/μL | A260/A280 | A260/A230 | ***终mRNA溶液体积 | IVT反应体系 | 折算产率 |
乐布斯产品 200U/μl | 1783.9 | 1.97 | 2.16 | 0.5mL | 100μL | 8.92mg/mL |
ZW市售产品 200U/μl | 1400.3 | 1.94 | 2.14 | 0.5mL | 100μL | 7.00mg/mL |
与ZW竞品对比测试，在3h反应时间下产量提升27.4%
5.2.更好的 冻融稳定性
在37℃ 24h、冻融5次条件下，样品稳定。
5.3.完善严苛的质量标准
独立的SEC-HPLC分析方法开发 RP-HPLC 分析方法开发
6. 产品用途
1- 合成单链 RNA，用于 mRNA 疫苗等制备。
2- 合成高特异性 RNA 探针。
3- 合成 siRNA 前体。
4- 制作 RNA 剪接反应（RNA splicing）的前体。
5- 利用帽类似物合成带帽 RNA
7. 产品包装
1- T7 RNA Polymerase, GMP Grade (50U/μl)。
2- T7 RNA Polymerase, GMP Grade (200U/μl)。
3- T7 RNA Polymerase, GMP Grade (可定制规格)。
8. 注意事项
1- 模板效率和孵化时间： 不同模板的产量会因模板的序列、结构、长度、纯度以及特定 RNA 聚合酶启动子的序列和长度而有所不同。影响转录产量的污染物包括核糖核酸酶或污染物，如苯酚、微量金属和 SDS。
2- 优化的反应: 推荐的反应条件可适用于大多数模板的体外转录，但是，对于某些模板，可以通过延长反应时间(4 小时-过夜反应)， 增加模板的用量来提高产率。
3- 保持 RNase-free 环境：使用无 RNase 管和移液枪；处理含有 RNA 的试剂盒组件或样品时应戴手套，并经常更换手套，特别是接触到 RNase 的潜在污染源，如门把手、 钢笔、铅笔和人体皮肤后。不使用时，应将所有试剂密封好。在孵育过程中，将所有含有 RNA 的试管密封。
4- 在配置反应体系时，可以加入 适当的RNase 抑制剂。
5- 由于配套 Transcription Buffer 内的成分浓度偏高，高盐环境会导致聚合酶失活，同时 buffer 中含其它多种成分物质，可能会与模板 DNA 形成沉淀，配制反应液时需调整组分加样顺序，计算好体系，先加水，然后加 Buffer，NTP，***加模板和酶，以防止反应buffer中的高浓度盐离子对酶造成影响。
9. 模板制备
带有双链 T7 启动子的线性化质粒、PCR 产物或者合成的 DNA 片段都可以作为 T7 RNA Polymerase 体外转录模板，模板可用TE 缓冲液或 RNase-free Water 溶解。
1- 质粒模板（建议每个反应加 1μg 线性化质粒作为模板）带 T7 启动子的质粒可以作为转录模板，质粒的线性化和纯度会影响转录的产量及 RNA 的完整性。环状质粒由于没有有效的终止，会转录出不同长度的 RNA 产物，为了得到特定长度的 RNA，质粒必须完全线性化，线性化的质粒请确保双链为平末端或编码链 5‘端为突出结构。
2- PCR 产物模板（建议每个反应加 0.1μg~1μg 作为模板） 带 T7 启动子的 PCR 产物可以作为体外转录模板。PCR 扩增模板时将 T7 启动子加在有义链的上游引物的 5’端。PCR 产物经纯化后作为模板。
3- 合成的 DNA 模板（建议每个反应加 0.1μg~0.5μg 作为模板） 合成的带有 T7 启动子的 DNA 片段也可以作为体外转录的模板。
10. 体外转录实验流程
1- 将各组分融化后分别混匀，短暂离心收集于管底，冰上储存备用。
2- 加入以下各组分：
组分 | 加入量 |
Transcription Buffer | 2 ul |
ATP/GTP/CTP/UTP Mix | Each 2mM |
Template DNA | 20ng-1μg |
T7 RNA Polymerase | 50 U |
RNase Free Wate | Up to 20 ul |
注：根据实际情况可以在反应体系中可添加 RNase Inhibitor 至 1U/μl，防止实验过程环境中RNase 污染。模板 DNA 应为 RNaseA-Free、高纯度，建议 OD260/280 为 1.8~2.0。
3- 用移液器轻轻混匀各组分，并短暂离心收集，37℃孵育 2-3 h。 为避免蒸发对反应体系的影响，建议在 PCR 仪中进行反应。可根据产物片段大小适当的调整反应时间，如合成小于 0.3 kb 的 RNA，可将反应延长至 4 h 或更长时间，16 h 过夜反应不会影响产物的质量。
4- 在反应体系中加入 1μl 的 DNase I ，37℃孵育 15 min，消化转录的 DNA 模板。相对于产物 RNA，模板 DNA 的含量非常低，一般不用去除，也可以用 DNase I 消化。
5- 合成的 RNA 经电泳分析、纯化后，可用于下游实验。产物浓度极高，需用 RNase-free Water 稀释后再检测。
