准药品级蛋白工具的由来
伴随着新冠疫情的爆发，催生了国外mRNA行业的火热。国内mRNA行业也在蓬勃发展，但当前mRNA配套产业尚不成熟，相关质量监管体系并不健全。
mRNA 生产加工过程中的关键酶原料，占整个反应过程中的重要成本。T7 RNA聚合酶是***通用的一种一步法IVT工具酶，按现行的法规文件既不属于原料药，也不属于国家二类药用辅料，同样目前国家也还未出台相关的指导性文件。相关酶工业无论是酶活鉴定方法、分析方法、质控放行文件体系均各成一派，如何筛选出合规的酶原料供应商，困扰着mRNA制药人。
乐布斯团队有多年外资药品研发经验同时也是***早一批国产化制药原料的从业者。深知现行国产化过程中的很多原料、耗材、器械的加工生产缺乏有效的GMP监管体系跟质量体系，无论是从产品的质量、批间稳定性、合规文件等均跟国际上存在显著差距。一方面是我们很多的创业者是科研岗位出身，缺乏GMP概念及培训；另一方面是这些年国产化在不断的做大做多，玲琅满目的复制推新。导致了大量的产品红海、资本红海，然而恰恰忽略了复制之后的改良与创新。
国产化装备耗材用户诟病的问题诸如：小试产品数据非常漂亮，产业化后产品品控严重下降；产品批与批之间差异性极大，不敢用到关键物料或者关键工艺步骤中；QA现场审计发现不符合GMP规范，整改仍然不到位；文件体系非常欠缺，注册申报及关联审批忧心忡忡……
针对国产化过程中的通病与痛点，乐布斯生物工程组建了拥有十几年生物制品discovery、R&D、IND、NDA/BLA经验的团队，用制药人的标准与思维为国产原料助力加码。未来核酸药物在医药领域扮演的角色会越来越重要，我们不确定未来国家对关键原料的监管及指导会到什么程度，如果标准的提高导致医药研发生产企业无原料可用或者关联审批原辅料厂家因为文件体系不健全影响商业化进度，或者因为产品的品质或者批件稳定性对药品研发生产本身造成影响，非常得不偿失。乐布斯生物工程团队一致决定，基于药品的研发注册商业化全流程开发配套的生物原料，建立完善的质量管控体系、建立完整的文件体系。通过自身的努力，为行业树立标杆、为关键酶工业标准制定奠定基础。让制药人专心于药品本身，而不是不同供应商之间的考察审核中。
关于T7 RNA聚合酶
作为生物大分子，mRNA 只能通过体外转录（IVT，in vitro transcription）的方法大规模合成，T7 启动子是目前转录效率***的启动子之一，因此采用 T7 RNA 聚合酶（T7 RNA Polymerase）进行体外转录可获得更多的合成产物。本制品 T7 RNA Polymerase（T7 RNA 聚合酶）为噬菌体 T7 DNA 编码的酶，是一种高度特异识别 T7 启动子序列的 DNA 依赖的 5'→3' RNA 聚合酶，以含有 T7 启动子序列的单链或双链 DNA 为模板，以 NTP 为底物，合成与 DNA 中一条链互补的 RNA。T7 RNA 聚合酶是体外转录生产治疗用 mRNA 的关键酶。本品为利用大肠杆菌大规模发酵表达的 GMP 级重组 T7 RNA 聚合酶，采用药用规格原辅料生产，并严格控制宿主蛋白质残留、核酸残留等，符合GMP 规范的产品生产与质量管理规程保障生产过程及所有原辅料可追溯。
关于质量体系
1.遵循药品GMP质量体系----不是药品的“药品”
√菌种溯源清晰，稳定的商业化菌种 | √QbD理念的工艺过程，可靠的活性及稳定性 |
√载体溯源清晰，合规的商业化授权 | √DOE方法确认，严格的批间稳定性 |
√抗性符合药典，药品级菌种建库 | √药品制造过程，完善的质控及数据支持 |
√定点突变技术，高效的酶催化活性 | √药典处方物料，完善的原料供应商管理 |
√蛋白浓度，RP-HPLC精确定量 | 稳定的比活，为生产投料偏差保驾护航 |
2.完善的放行检测
项目 | 标准 |
外观 | 应为澄明液体 |
可见异物 | 不超过3个/支 |
装量 | 出厂标定装量不低于额定装量 |
鉴别（SDS-PAGE） | 应与参比条带一致 |
蛋白浓度（RP-HPLC外标法） | 应为标识浓度的±10% |
pH值 | 7.9±0.5 |
细菌内毒素 | ＜10EU/mL |
非特异性核酸酶残留 | 琼脂糖电泳凝胶显示应为阴性 |
核酸内切酶残留 | 琼脂糖电泳凝胶显示应为阴性 |
核酸外切酶残留 | 琼脂糖电泳凝胶显示应为阴性 |
RNA酶残留 | 琼脂糖电泳凝胶显示应为阴性 |
HCP残留 | ≤50ng/mg |
HCD残留 | ≤100pg/mg |
镍盐残留 | ≤10ppm |
重金属残留 | ≤10ppm |
纯度（SEC-HPLC） | ≥95% |
纯度（RP-HPLC） | ≥95% |
活性 | 应不低于50KU/mL |
微生物限度 | 应不高于1CFU/mL |
3. 遵循生产规范
1-《GMP 附录-细胞治疗产品》国家药品监督管理局。
2-《人用基因治疗总论-中国药典2020》国家药典委。
3- USP Chapter , Ancillary Materials for Cell, Gene, and Tissue-Engineered Products 用于细胞治疗，基因治疗和组织工程产品中的辅料。
4- USP Chapter , Growth Factors and Cytokines Used in Cell Therapy Manufacturing 细胞治疗产品生产过程中细胞因子和生长因子。
5- Ph. Eur. General Chapter 5.2.12, Raw Materials of Biological Origin for the Production of Cell-based and Gene Therapy Medicinal Products 用于生产细胞或基因治疗药物的生物来源原料。
4. 产品基本信息
| 来源 | 携带噬菌体T7 DNA基因的E.coli |
| 储存缓冲液 | 50 mM Tris-HCl (pH 7.9)；100 mM NaCl；10mM DTT；1 mM EDTA；0.1% Triton X-100；50% (v/v) Glycerol |
| 储存条件 | -20±5℃ |
5. 产品特点
5.1更高的酶活
通过定点突变技术，对 T7 启动子有高度特异性。相同完整率下，高于市售主流竞品的产率。
RNA生成量（μg） | ||
时间（min） | KK市售产品 | 乐布斯产品 |
180 | 64.8 | 97.8 |
150 | 65.3 | 95.1 |
120 | 59 | 93.6 |
90 | 57.1 | 91.1 |
60 | 55.5 | 86.7 |
30 | 43.6 | 67.4 |
10 | 24.9 | 61.6 |
与KK竞品对比测试，在3h反应时间下产量提升50.9%
样品名称 200U/μl | 浓度μg/μL | A260/A280 | A260/A230 | ***终mRNA溶液体积 | IVT反应体系 | 折算产率 |
乐布斯产品 | 1783.9 | 1.97 | 2.16 | 0.5mL | 100μL | 8.92mg/mL |
ZW市售产品 | 1400.3 | 1.94 | 2.14 | 0.5mL | 100μL | 7.00mg/mL |
与ZW竞品对比测试，在3h反应时间下产量提升27.4%
5.2.准确标识蛋白浓度
我公司开发的RP-HPLC外标法检测蛋白浓度符合药典规范，相比于市面上SDS-PAGE、Bradford、BCA等方法等拥有更高的准确度与灵敏度。同时可以消除核酸等杂质的影响。
5.3.双标法纯度鉴定标准
我公司开发了SEC-HPLC、RP-HPLC双标法鉴定蛋白纯度。
SEC-HPLC纯度鉴定方法相比SDS-PAGE拥有更高的灵敏度、更规范的质量管控。
SEC-HPLC无法鉴别氨基酸脱落、错配、结构修饰等，我公司额外开发了RP-HPLC用于检测氨基酸脱落、错配、修饰问题。
SEC-HPLC质量分析 RP-HPLC质量分析
5.4.比活研究
在酶制剂厂家往往忽略但是对mRNA企业非常重要的一个参数，定义为每单位蛋白单位时间内的RNA生成量。计算公式为：比活=活性/蛋白浓度，乐布斯将比活引入到乐布斯酶制剂的生产管理体系中。根据乐布斯产品质量文件出厂标识，可以计算出每批次的比活。比活更能反映出酶本身的活性及催化稳定性，稳定的比活可以大大降低投料的批间差，同时可以抑制沉淀等副反应。从而保证工艺放大及批生产投料的稳定性。
Test Item 检验项目 | Specification 标准 | 22P11-P20230201-G1 | 22P11-P20230201-G2 | 22P11-P20230202-G1 | 22P11-P20230202-G2 |
外观 | 应为澄明液体 | 无色澄明液体 | 无色澄明液体 | 无色澄明液体 | 无色澄明液体 |
可见异物 | 不超过3个/支 | 未见可见异物 | 未见可见异物 | 未见可见异物 | 未见可见异物 |
装量 | 不少于标识体积的100% | 符合规定 | 符合规定 | 符合规定 | 符合规定 |
鉴别（SDS-Page） | 应与参比品条带一致 | 与参比品条带一致 | 与参比品条带一致 | 与参比品条带一致 | 与参比品条带一致 |
蛋白浓度（RP外标法） | 报告检测值 | 0.56mg/ml | 2.37mg/ml | 0.45mg/ml | 1.96mg/ml |
pH | 7.9±0.5 | 7.90 | 7.95 | 7.87 | 7.88 |
细菌内毒素残留 | ＜10EU/mL | ＜10EU/mL | ＜10EU/mL | ＜10EU/mL | ＜10EU/mL |
非特异性核酸酶残留 | 琼脂糖凝胶电泳显示应为阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
核酸内切酶残留 | 琼脂糖凝胶电泳显示应为阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
核酸外切酶残留 | 琼脂糖凝胶电泳显示应为阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
RNA酶残留 | 琼脂糖凝胶电泳显示应为阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
HCP残留 | ≤50ng/ mg | 16.64ng/mg | 16.07ng/mg | 26.47ng/mg | 22.50ng/mg |
HCD残留 | ≤100pg/ mg | ＜7.2pg/mg | ＜7.2pg/mg | ＜7.5pg/mg | ＜7.5pg/mg |
镍盐残留 | ≤10ppm | ＜10ppm | ＜10ppm | ＜10ppm | ＜10ppm |
重金属残留 | ≤10ppm | ＜10ppm | ＜10ppm | ＜10ppm | ＜10ppm |
纯度（SEC-HPLC） | ≥95.0% | 99.88% | 99.80% | 99.84% | 99.83% |
纯度（RP-HPLC） | ≥95.0% | 99.34% | 99.70% | 99.24% | 99.78% |
活性 | 应不低于50KU/mL; | 70.9 KU/mL | 275.1 KU/mL | 54.9 KU/mL | 227.1 KU/mL |
微生物限度 | 应不高于1CFU/1mL | ＜1CFU/ml | ＜1CFU/ml | ＜1CFU/ml | ＜1CFU/ml |
参考比活（KU/mg蛋白） | 126.6KU/mg | 116.1KU/mg | 122.0KU/mg | 115.9KU/mg |
5.5冻融稳定性
在37℃ 24h、冻融5次条件下，样品稳定。
5.6.CoA文件
CoA 样本（50KU/mL） CoA 样本（200KU/ml）
5.7.完善的文件体系
乐布斯建立了完善的文件体系，具体MSDS文件、RSF文件、DMF文件请向乐布斯工作人员索取。
关于乐布斯
乐布斯(上海)生物科技有限公司，是一家专注于新兴生物治疗市场分离制备相关耗材及工艺的供应商。我公司主要研发、生产、经营销售细胞治疗、基因治疗、mRNA及核酸药物工艺开发相关层析介质、无菌定制流路、蛋白酶工程的加工生产以及相关工艺开发的综合性公司。
我公司与南京大学、新西兰奥克兰大学、复旦大学、浙江大学、北京理工大学等众多研究机构合作。专注于细胞治疗、基因治疗、mRNA、小核酸、合成生物学专用层析介质及工具酶的开发。
设有南京微球研发基地、安徽微球生产基地、河北衡水化学合成及后处理研发中心、山东淄博商业化车间。上海奉贤蛋白工程研发产业化基地。公司技术和研发实力雄厚，是国内众多生物医药上市企业信赖的长期合作伙伴。
乐布斯同时授权经营国际知名品牌瑞普利金全系列工艺产品，主要代理产品为：XCell ATF灌流设备、Spectrum TFF切向流设备、中空纤维膜柱、平板膜包、层析系统、预装层析柱、层析介质。同时代理REBEL 全自动生化分析仪、 代理Implen 超微量分光光度计、代理安及义反应器、水机等产品。
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